Estruturas cristalinas revelam mecanismos catalíticos e reguladores da dupla

Nature Communications volume 13, Número do artigo: 4880 (2022) Citar este artigo

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A enzima E1 Uba6 inicia a transdução de sinal ativando a ubiquitina e a proteína semelhante à ubiquitina FAT10 em um processo de duas etapas envolvendo catálise sequencial de adenilação e formação de ligação tioéster. Para obter insights mecanísticos sobre esses processos, determinamos a estrutura cristalina de um complexo Uba6/ubiquitina humano. Duas arquiteturas distintas do complexo são observadas: uma em que Uba6 adota uma conformação aberta com o sítio ativo configurado para catálise de adenilação, e uma segunda conformação fechada drasticamente diferente na qual o sítio ativo de adenilação é desmontado e reconfigurado para catálise de formação de ligação tioéster . Surpreendentemente, uma molécula de inositol hexaquisfosfato (InsP6) se liga a um sítio alostérico não identificado anteriormente em Uba6. Nossos dados estruturais, bioquímicos e biofísicos indicam que o InsP6 inibe alostericamente a atividade do Uba6, alterando a interconversão das conformações aberta e fechada do Uba6, ao mesmo tempo em que aumenta sua estabilidade. Além de revelar os mecanismos moleculares de catálise por Uba6 e regulação alostérica de suas atividades, nossas estruturas fornecem uma estrutura para o desenvolvimento de inibidores específicos de Uba6 e levantam a possibilidade de regulação alostérica de outros E1s por metabólitos celulares de ocorrência natural.

A modificação pós-traducional (PTM) de proteínas por ubiquitina (Ub) e proteínas semelhantes a Ub (Ubls) sustenta a regulação de processos celulares fundamentais, incluindo controle do ciclo celular, reparo do DNA, transdução de sinal e imunidade1. A conjugação Ub/Ubl requer interações e atividades sequenciais de cascatas paralelas de enzimas compreendendo E1, E2 e, mais frequentemente, E3s, que juntas ativam, transportam e ligam Ub/Ubl a proteínas-alvo2. Os dois Ub E1s humanos, Uba1 e Uba6, funcionam como guardiões da cascata de conjugação de Ub acoplando a hidrólise de ATP (adenilação) com a formação de uma ligação tioéster E1-Ub de alta energia (tiolação). Isso é seguido pela transferência de Ub ativado para repertórios distintos de enzimas E2 cognatas (transtioesterificação)3,4,5,6,7,8,9. Enquanto Uba1 é específico para ativação de Ub, Uba6 exibe dupla especificidade para Ub e FAT10 5,8, sendo este último um Ubl envolvido na progressão mitótica10, imunidade11,12,13,14 e implicado no câncer15,16,17,18,19 ,20,21.

Embora Uba6 tenha iludido a caracterização estrutural até o momento, vários estudos mostraram que Uba1 é uma grande enzima multidomínio na qual cada domínio desempenha um papel funcional distinto durante a catálise da adenilação de Ub22,23, formação de ligação tioéster E1~Ub24,25,26, e transtioesterificação E1-E2-Ub27,28,29,30. Os domínios de adenilação ativos e inativos (AAD e IAD, respectivamente) são responsáveis ​​pelo recrutamento inicial de Ub e também abrigam a maquinaria catalítica para adenilação do terminal C de Ub na primeira etapa da ativação de Ub. O domínio E1 Cys é organizado como dois semidomínios globulares denominados primeiro e segundo semidomínios catalíticos de cisteína (FCCH e SCCH, respectivamente). O domínio FCCH desempenha um papel no reconhecimento de Ub e o domínio SCCH abriga o resíduo cisteína catalítico envolvido na formação da ligação Ub tioéster durante a segunda etapa da ativação de Ub. Estudos recentes revelaram que E1s sofrem grandes mudanças conformacionais que são necessárias para adenilação e formação de ligação tioéster24,25,31,32. Estudos de Uba125, bem como o E1 para o Ubl SUMO, mostraram que a adenilação ocorre com o E1 em uma conformação "aberta" e que a formação da ligação tioéster envolve uma rotação de ~ 130° (ou "fechamento") do domínio SCCH que transita a cisteína catalítica para o sítio ativo31. Por fim, o domínio ubiquitina-fold (UFD) está envolvido no reconhecimento molecular de E2 e subsequente transferência de Ub da cisteína catalítica E1 para E226,27,28,29,30. Prevê-se que Uba6 abriga uma organização de domínio semelhante a Uba1 com base na análise de sequência5. Na ausência de dados estruturais, no entanto, os mecanismos moleculares pelos quais Uba6 ativa Ub e FAT10 são desconhecidos. Além disso, enquanto quase todo o Uba1 nas células de mamíferos em proliferação está no estado Uba1~Ub ativado, o Uba6 é apenas 50% ativado em condições semelhantes6,33. A base molecular para esta diferença ainda precisa ser determinada.