Estrutura cristalina de um elemento de replicação de RNA de trevo 5' enteroviral altamente conservado

Nature Communications volume 14, Número do artigo: 1955 (2023) Citar este artigo

2622 Acessos

17 Altmétrica

Detalhes das métricas

A extremidade 5' extrema do genoma de RNA do enterovírus contém um domínio semelhante a um trevo conservado que recruta as proteínas 3CD e PCBP necessárias para iniciar a replicação do genoma. Aqui, relatamos a estrutura cristalina com resolução de 1,9 Å deste domínio do genoma CVB3 em complexo com uma chaperona de anticorpo. O RNA se dobra em uma junção antiparalela de quatro vias do tipo H compreendendo quatro subdomínios com hélices sA-sD e sB-sC empilhadas coaxialmente. As interações de longo alcance entre um A40 conservado no loop sC e a hélice Py-Py dentro do subdomínio sD organizam orientações quase paralelas das hélices sA-sB e sC-sD. Nossos estudos de RMN confirmam que essas interações de longo alcance ocorrem em solução e sem o acompanhante. As análises filogenéticas indicam que nossa estrutura cristalina representa uma arquitetura conservada de domínios enterovirais tipo trevo, incluindo as interações A40 e Py-Py. Os estudos de ligação à proteína sugerem ainda que a arquitetura em forma de H fornece uma plataforma pronta para recrutar 3CD e PCBP2 para replicação viral.

O gênero enterovírus da família Picornaviridae inclui numerosos vírus patogênicos responsáveis ​​por muitas doenças humanas, como resfriado comum, poliomielite, paralisia flácida aguda e miocardite1,2,3. Esses vírus contêm um genoma de RNA de fita simples de sentido (+) com cerca de 7500 nucleotídeos (nts), que é poliadenilado na extremidade 3' e ligado covalentemente com a proteína viral VPg na extremidade 5' (Fig. 1a)4 ,5,6,7. Todo o genoma consiste em um único quadro de leitura aberta (ORF) flanqueado pelas regiões não traduzidas (UTRs) 5' e 3' altamente conservadas. O ~750-nt 5'-UTR abriga domínios de RNA modulares essenciais para a tradução e replicação do genoma viral dentro das células hospedeiras (Fig. 1 complementar). Aproximadamente 660 nts do 5'-UTR da posição 90 a 750, localizados imediatamente a montante da ORF, contribuem para um sítio interno de entrada do ribossoma (IRES) que promove a tradução do genoma viral através de um mecanismo independente de cap8,9,10,11. Os 90 nts restantes no extremo 5'-final de um genoma enteroviral são essenciais para a replicação e foram propostos para adotar uma estrutura secundária de RNA semelhante a um trevo (5'CL) que serve como uma plataforma para integrar os fatores proteicos virais e celulares necessários para iniciar a replicação do genoma viral8,12,13,14,15. Aqui, relatamos uma estrutura cristalina de alta resolução de um RNA intacto de trevo enteroviral de um membro da espécie de enterovírus B - o coxsackievirus B3 (CVB3).

um esquema de um genoma de enterovírus representando a localização do 5'CL e sua estrutura secundária proposta com sítios de ligação putativos para 3CD viral e proteínas PCBP do hospedeiro. b Estrutura secundária do construto de cristalização CVB3 5'CL2a com base na análise bioquímica anterior, onde o motivo 5'-GAAACAC-3' do epítopo de ligação de Fab BL3-6 substitui o loop L2 do subdomínio sB. Os nucleotídeos coloridos em cinza representam as mutações ou inserções em comparação com a sequência do tipo selvagem. c A estrutura cristalina do CVB3 5′CL2a cocristalizou com o Fab BL3-6 e resolveu em resolução de 1,9 Å. O Fab é obscurecido em vistas giradas da estrutura do RNA para maior clareza. Os painéis de figuras e os rótulos correspondentes são coloridos de forma análoga para facilitar a comparação.

O 5'CL é altamente conservado entre todos os membros do gênero enterovírus. Devido a essa alta conservação das características estruturais entre 5'CLs enterovirais, os genomas quiméricos de enterovírus com 5'CLs trocados demonstraram gerar partículas virais viáveis16,17,18. A estrutura secundária de RNA proposta consiste em quatro subdomínios altamente organizados designados sA, sB, sC e sD (Fig. 1a). O subdomínio sA forma o caule base da folha de trevo, enquanto os subdomínios sB, sC e sD se dobram em uma estrutura haste-laço distinta. O subdomínio sD recruta a proteína de fusão viral 3CD – precursora da protease viral 3C e da RNA polimerase dependente de RNA viral (RdRp) D – por meio de interações específicas da alça sD com a protease 3C17,19,20,21. O subdomínio sB com uma sequência rica em C em sua alça recruta a proteína hospedeira de ligação a poli(C) (PCBP) para facilitar a circularização do genoma viral por meio de interações com a proteína de ligação a poli(A) (PABP) complexada com o 3 ′-end poly(A) tail19,22,23,24,25,26,27,28,29. Um domínio de RNA de haste-alça, cre, dentro da região de codificação 2C do genoma viral também interage com o 3CD30,31,32, promovendo a uridilação da proteína VPg viral31,33, que depois serve como um primer para o (-) Síntese de RNA de cadeia pelo RdRp D30,34. Além disso, a sequência e a integridade estrutural dos 5'CLs também demonstraram influenciar a uridilação de VPg e a estabilidade genômica, ressaltando vários papéis críticos das características estruturais do RNA nos 5'CLs enterovirais14,35. Apesar das intensas pressões de seleção, a alta conservação do 5'CL nos genomas enterovirais também destaca os requisitos virais para preservar as estruturas de RNA primárias, secundárias e terciárias do 5'CL para interações com as proteínas derivadas do vírus e do hospedeiro durante o genoma viral. replicação. No entanto, não temos as estruturas tridimensionais de alta resolução do 5'CL enteroviral intacto, limitando nossa compreensão desse processo virológico fundamental que tem um tremendo potencial para o desenvolvimento de terapias direcionadas contra infecções por enterovírus.